Dacă ați petrecut vreodată timp analizând diapozitive de patologie digitală sau imagistică mostre de cercetare, probabil v-ați întrebat cum un scaner cu lame de microscop captează fiecare detaliu cu atâta precizie - chiar și atunci când lama are variații subtile de înălțime sau imperfecțiuni minuscule care ar arunca focalizarea unei camere standard. În calitate de furnizor de scanere de diapozitive digitale de înaltă performanță, primesc această întrebare tot timpul și este una dintre cele mai importante părți ale motivului pentru care echipamentele noastre oferă rezultate fiabile și consistente zi de zi. Să dezvăluim exact cum funcționează mecanismul de focalizare, de ce este important pentru diferite cazuri de utilizare și cum scanerele noastre sunt proiectate pentru a excela în acest domeniu.
În primul rând, să începem cu elementele de bază: lamele de microscop nu sunt perfect plate. O lamă de sticlă standard are aproximativ 1 mm grosime, dar probele biologice (cum ar fi secțiuni de țesut, culturi celulare sau preparate citologice) sunt montate deasupra acesteia, iar înălțimea lor poate varia cu 10 până la 50 de microni - uneori mai mult, în funcție de modul în care a fost preparată proba. Chiar și praful sau resturile minore de pe diapozitiv adaugă straturi mici, neașteptate. Pentru ca un scaner să captureze o imagine clară, focalizarea sa trebuie să se ajusteze continuu pe măsură ce se deplasează pe diapozitiv și trebuie să facă asta mai repede decât poate clipi un ochi uman, menținând în același timp precizia într-o fracțiune de micron. Asta nu este o operație mică.
Majoritatea scanerelor de lame de microscop folosesc una dintre cele două tehnologii de focalizare de bază: focalizare automată pasivă (AF) sau AF activă, iar multe modele de ultimă generație le combină pe ambele pentru a obține cele mai bune din ambele lumi. Să începem cu AF pasiv, pentru că asta este ceea ce am integrat în scanerele noastre cu câmp luminos de bază, cum ar fi Brightfield Slide Scanner EScan-1200. AF pasiv nu emite niciun semnal extern; în schimb, analizează lumina reflectată de diapozitiv pentru a determina unde este focalizarea cea mai clară. Software-ul sistemului analizează contrastul imaginii prin ferestre mici în timp ce scanerul mișcă lentila în sus și în jos. Când contrastul este cel mai mare, acesta este punctul de focalizare clară. Pentru aplicațiile în câmp luminos, în care mostrele sunt colorate cu coloranți care creează diferențe distincte între lumină și întuneric, acest lucru funcționează foarte bine. Este suficient de rapid pentru scanarea diapozitivelor cu câmp luminos la mărire de 20x sau 40x și menține costurile mai mici pentru laboratoarele care nu au nevoie de imagistică prin fluorescență. Dar AF pasiv are limitele sale – dacă o diapozitivă are o zonă foarte uniformă, cu contrast redus (cum ar fi o margine de sticlă transparentă sau o probă subțire, nepătată), software-ul nu poate detecta diferențele de contrast și focalizarea s-ar putea deplasa.
Aici intervine AF activ și aceasta este tehnologia pe care o acordăm prioritate pentru scanerele de calitate pentru cercetare, cum ar fi scanerul nostru de diapozitive cu fluorescență de calitate. Active AF folosește un senzor sau o sursă de lumină separată pentru a proiecta un semnal pe diapozitiv, apoi măsoară modul în care acel semnal se reflectă înapoi pentru a calcula distanța exactă de la obiectiv la probă. Cele mai comune două tipuri de AF activ utilizate în scanerele de diapozitive sunt triangularea cu laser și focalizarea bazată pe aberații cromatice. Triangularea cu laser este mai simplă: un fascicul laser cu infraroșu de putere redusă este îndreptat spre diapozitiv, iar un senzor al camerei detectează locul în care punctul laser aterizează pe diapozitiv. Dacă diapozitivul este prea aproape sau prea departe, spotul se mișcă pe senzor, iar scanerul ajustează poziția lentilei pentru a aduce spotul înapoi la punctul ideal. Acest lucru funcționează chiar și pe mostre cu contrast scăzut, deoarece măsoară distanța fizică, nu contrastul luminos. Focalizarea aberației cromatice folosește o sursă de lumină care se împarte în lungimi de undă de culoare diferite; fiecare lungime de undă se concentrează la o distanță ușor diferită, astfel încât scanerul compară modul în care fiecare culoare se reflectă pe diapozitiv pentru a calcula focalizarea. Acest lucru este util în special pentru diapozitivele cu fluorescență, care pot avea un contrast chiar mai mic decât probele de câmp luminos, deoarece fluoroforele emit lumină mai degrabă decât o reflectă.
Multe dintre scanerele noastre, cum ar fi Scannerul de diapozitive de patologie digitală, utilizează un sistem AF hibrid care combină AF pasiv și activ pentru a elimina punctele moarte. Iată cum funcționează: când scanerul încarcă pentru prima dată un diapozitiv, folosește AF activ pentru a mapa profilul de înălțime al întregului diapozitiv în primele 10 secunde. Acest lucru creează o „hartă topografică” a diapozitivei, marcând fiecare denivelare, cufundare și variație. Apoi, pe măsură ce scanerul se deplasează pe diapozitiv captând imagini, folosește AF pasiv pentru a regla rapid focalizarea pentru fiecare câmp vizual individual, folosind harta pre-încărcată numai atunci când întâlnește zone în care AF pasiv s-ar lupta. Această abordare hibridă reduce timpul de scanare, asigurând în același timp că și probele dificile, cum ar fi diapozitivele de țesut încorporate în parafină, cu secțiuni groase și inegale, rămân focalizate pe întreaga imagine.
O altă parte cheie a mecanismului de focalizare este motorul piezo, care este cel care mișcă de fapt lentila sau scena pentru a regla focalizarea. Motoarele piezo sunt utilizate în locul motoarelor pas cu pas standard, deoarece sunt mai rapide și mai precise: pot regla poziția în nanosecunde, cu o precizie de până la 10 nanometri - mult mai mic decât cel mai mic detaliu dintr-o probă de țesut. Pentru scanarea cu mărire mare (cum ar fi 60x sau 100x, care este comună în patologia de cercetare), această precizie nu este negociabilă. Dacă focalizarea este dezactivată chiar și cu 0,5 microni, imaginea va fi neclară și veți rata structurile mici, cum ar fi nucleele sau markerii de proteine. Scanerul nostru de diapozitive cu fluorescență multicanal folosește un sistem de motor piezo care poate face peste 1.000 de ajustări de focalizare pe secundă, ceea ce înseamnă că poate scana o diapozitivă cu fluorescență de 40x în jumătate din timpul unui scaner cu un motor pas cu pas, fără a pierde claritatea.
Stai, dar cum rămâne cu cazurile în care mostrele sunt groase? Unele mostre biologice, cum ar fi diapozitivele întregi de organism sau culturile de celule 3D, au o grosime de zeci de microni, așa că nici măcar un singur strat nu poate capta toate detaliile. Aici intervine caracteristica de stivuire în Z a scanerelor noastre, care se leagă direct de mecanismul de focalizare. În loc să focalizeze o dată pe câmp vizual, scanerul captează 3 până la 5 imagini la diferite planuri de focalizare, apoi le unește pentru a crea o singură imagine focalizată care include fiecare strat al eșantionului. Pentru aplicațiile de cercetare, acest lucru este esențial pentru studierea structurii 3D a țesuturilor sau co-localizarea markerilor de fluorescență multipli. Scanerul nostru digital de patologie GScan-60 are un mod de stivuire în Z care ajustează focalizarea în pași de 2 microni, astfel încât să nu pierdeți niciun detaliu din probele clinice groase.
Am văzut direct cât de slabă focalizare poate deraiați cercetarea sau munca de diagnosticare a unui laborator. Un coleg de-al meu de la un mic laborator de patologie mi-a spus odată că folosesc un scanner de diapozitive mai ieftin, care ar pierde concentrarea asupra marginilor diapozitivelor, forțându-i pe patologii lor să ajusteze manual 20% din imagini. Asta a pierdut ore de timp și a dus la întârzieri în diagnosticarea pacienților. Când au trecut la scanerele noastre, sistemul hibrid AF a redus ajustările manuale la mai puțin de 1%, iar timpul de scanare a scăzut cu 30%. Aceasta este valoarea reală a unui mecanism de focalizare bine conceput — nu este vorba doar de obținerea unei imagini clare; este vorba despre economisirea timpului, reducerea erorilor umane și posibilitatea de a obține rezultate mai precise.
Există câteva mituri comune despre focalizarea scanerului de diapozitive pe care vreau să le clarific și eu. Unii oameni cred că o mărire mai mare înseamnă că aveți nevoie de un sistem de focalizare mai complicat, dar este mai puțin despre mărire și mai mult despre tipul de eșantion. De exemplu, o diapozitivă cu câmp luminos de 40x a unei probe de țesut colorat necesită o focalizare precisă, dar o lamă de 20x de culturi celulare pe o lamă de sticlă plată ar putea funcționa bine cu AF pasiv. Alte mituri: că AF activ este întotdeauna mai lent decât AF pasiv. Cu motoarele piezo moderne, AF activ este de fapt mai rapid, deoarece nu trebuie să scaneze mai multe poziții pentru a găsi cel mai clar contrast - calculează distanța direct.
Un alt factor important în focalizare este calibrarea. Chiar și cel mai bun mecanism de focalizare nu va funcționa dacă nu este calibrat în mod regulat. Scanerele noastre vin cu rutine de calibrare automată care rulează de fiecare dată când încărcați un nou tip de diapozitiv și vă oferim ghiduri pas cu pas pentru calibrarea manuală, dacă este necesar. De asemenea, includem diapozitive de testare cu fiecare scaner, astfel încât laboratoarele să poată verifica dacă focalizarea este corectă. Pentru setările de cercetare, în care consecvența între experimente este esențială, această calibrare asigură că imaginile din diferite scanări sunt comparabile, chiar și la câteva luni.
Acum, să vorbim despre modul în care ne proiectăm mecanismele de focalizare pentru a se potrivi diferitelor nevoi ale clienților. Un laborator de cercetare care scanează diapozitive cu fluorescență are nevoie de un sistem de focalizare care poate gestiona mai mulți fluorofori, care pot avea lungimi de undă de emisie diferite. Scanerul nostru de diapozitive cu fluorescență de calitate pentru cercetare este proiectat cu un senzor care ține cont de diferite lungimi de undă de lumină, astfel încât focalizarea rămâne constantă indiferent dacă scanați canale DAPI (albastru), FITC (verde) sau Texas Red (roșu). Pentru laboratoarele de patologie digitală, care procesează sute de diapozitive pe zi, viteza este critică — sistemul nostru AF hibrid GScan-60 poate scana un întreg diapozitiv în mai puțin de 5 minute, iar mecanismul de focalizare nu devine mai puțin precis în mii de scanări, deoarece folosim componente durabile, de calitate industrială.
De asemenea, clienții au întrebat despre concentrarea pe diapozitive umede, cum ar fi diapozitivele pentru imagini cu celule vii. Scanerele noastre pot gestiona diapozitive umede, dar vă recomandăm să utilizați modul AF activ, deoarece mostrele umede pot avea reflexii de suprafață care confundă AF pasiv. AF activ pe bază de laser poate pătrunde în stratul subțire de lichid de pe diapozitiv pentru a se concentra asupra eșantionului în sine, ceea ce este un mare avantaj pentru laboratoarele care efectuează imagini time-lapse ale culturilor celulare.
La sfârșitul zilei, mecanismul de focalizare este eroul necunoscut al scanerului cu lame de microscop. Este partea care funcționează în culise pentru a transforma o lamă de sticlă neclară într-o imagine digitală clară și detaliată pe care cercetătorii o pot analiza, patologii o pot folosi pentru a pune diagnostice și pe care clinicienii se pot baza pentru planurile de tratament. Indiferent dacă conduceți un mic laborator de diagnosticare, un laborator de cercetare universitar sau o companie farmaceutică care testează noi medicamente, un sistem de focalizare fiabil nu este un lux - este o necesitate.
Dacă sunteți în căutarea unui scanner de diapozitive cu microscop și doriți să aflați mai multe despre modul în care tehnologia noastră de focalizare se potrivește nevoilor dvs., echipa noastră este aici pentru a vă ajuta. De la scanere cu câmp luminos pentru diagnosticare de rutină la scanere cu fluorescență de cercetare pentru imagistica avansată, vă putem ghida prin caracteristicile care contează cel mai mult pentru munca dvs. Indiferent dacă sunteți interesat de EScan-1200 pentru laboratorul dumneavoastră de patologie, de GScan-60 pentru scanare de mare capacitate sau de scanerele noastre cu fluorescență multicanal pentru cercetarea dvs., suntem gata să discutăm despre modul în care echipamentele noastre vă pot eficientiza fluxul de lucru și vă pot îmbunătăți rezultatele.
Referințe
- Agrawal, M. și Gupta, R. (2021). Tehnologii de focalizare automată pentru scanere de diapozitive de patologie digitală: o analiză comparativă. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., şi colab. (2020). Mecanisme de focalizare de înaltă precizie pentru sisteme de imagistică cu diapozitive întregi. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Organizația Mondială a Sănătății. (2019). Patologia digitală pentru aplicații de diagnostic și cercetare: specificații tehnice și bune practici. OMS Press, Geneva.
